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密度梯度细胞分离法

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标签: 密度梯度细胞 分离

本实验主要用于分离细胞。

实验方法
  • 密度梯度细胞分离法
实验方法原理 制备密度梯度液,通过密度梯度液离心细胞,收集各梯度组分,用培养基稀释,培养细胞。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
通过下述方法之一制备密度梯度液:

(a)分层铺放法:

(i)调整 Percoll 密度至 1.10 g/CC,渗透压为 290 mOsm/kg 。

(ii)将 Penroll 与不同比例的常规培养基混合达到所需的密度范围(例如,1.020~1.100 g/ml ), 一般为 10 或 20 个级差。

(iii)在 25 ml 离心管中,用吸管、注射器和蠕动泵,每个密度取 1 ml 或 2 ml,从最高密度起,逐层地将一种密度液铺放在另一层上,建立起一种阶梯性密度梯度。也可以从低密度铺起,用注射器或蠕动泵,将髙一级密度的溶液注射到上一级的下面。后一种方法也许更可取。

密度梯度液可以立即使用或放置过夜。

(b)使用梯度形成器:

一种连续性的线性梯度可以在梯度形成器里通过混合不同浓度的 Percoll 而实现。例如,在梯度发生器里混合 1.020 g/ml 及 1.080 g/cc 的 Percoll(Fisons、Pharmacia、Buchler)。



(c)离心法:

(i)在离心管中加人含密度为 1. 085 g/cc Percoll 的培养基。

(ii)20000 g 离心 1 h 。

(iii) 离心产生一个“S”型的密度梯度,其形状是由 Percoll 的初始浓度、离心时间、离心力、离心管形状以及离心方式所决定的。



1. 胰蛋白酶消化细胞,重新悬浮于加了血清或胰蛋白酶抑制剂的培养基中,确保是单细胞悬液。

2. 用一个注射器,移液管或末端纤细的吸管将含 2×107 个细胞的 2 ml 细胞悬液小心平铺在梯度液的顶端。

3. 离心管直立在台面上 4 h,让细胞在 1 g 的状态下自由沉降,或者在 100~1000 g 之间离心 20 min。如果用后一种方法,要在离心开始时逐渐地加大离心速度,并且在离心快要结束时不要人为制动。

4. 用一个注射器或梯度收集器(Fisons ) 收集细胞。1 ml 的最可以收集到一个 24 孔培养板中,0.1 ml 的量则收集于一个微滴定板上。每间隔一定时间应当取样进行细胞计数及梯度液的密度(β)测定。密度测定可以使用折光仪(Hilger) 或密度计(Paar)。

5. 每孔加入等体积的培养基,混匀以保证细胞能接触孔的底部。培养 24~48 h 后,更换培养基以除去 Percoll。

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注意事项

1. 确保胰蛋白酶消化细胞后形成的是单细胞悬液。


2. 严格按照操作流程,离心结束不可人为制动。

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实验问答
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